胃癌干细胞的研究现状及发展方向

作者:1 | 来源: 中华肿瘤杂志 | 时间: 2014-12-29 15:52:51 | 浏览: 163 | 评论:  0 | 分享: 

近10 年来, 由于卫生条件的改善、饮食结构的调整和抗幽门螺旋杆菌的普及, 胃癌的死亡率有所下降, 但全球每年仍有约100 万的新发病例及70 余万的死亡病例[1 -2]。大部分胃癌患者在确诊时已属中晚期, 而进展期和转移性胃癌患者的中位生存时间仅有1 年左右[3]。尽管靶向药物已经应用于胃癌的临床治疗, 但治疗过程中肿瘤复发、转移和耐药仍是限制其疗效的主要因素。因此, 研究胃癌复发、转移和耐药的机制, 寻找高度特异性治疗靶标是提高胃癌疗效乃至根治的重要途径, 而近年来兴起的肿瘤干细胞学说为该途径提供了新的思路。 

肿瘤干细胞学说认为, 肿瘤干细胞是肿瘤组织中一群具有自我更新能力并可分化为异质性肿瘤细胞的细胞亚群[3]。基于检测自我更新和多向分化能力的小鼠异种移植成瘤实验被认为是鉴定肿瘤干细胞的金标准。截至目前, 肿瘤干细胞已在结肠癌、乳腺癌、肺癌等20 余种实体瘤及血液系统肿瘤中被发现和证实[4 -5]。胃癌干细胞的研究主要集中在2009 年Takaishi 等[6] 将CD44 标记为胃癌干细胞的特异性标志物以后, 由此引发了关于胃癌干细胞的来源、特性、分选、鉴定以及靶向胃癌干细胞的药物研发等一系列研究。 

胃癌干细胞的来源 

目前的研究表明, 胃癌干细胞主要来源于多分化潜能干细胞(胃黏膜干细胞和骨髓源性干细胞)的恶变和终末分化细胞的干性重获。胃黏膜干细胞具有自我更新和分化为各级胃细胞的能力, 被认为是胃癌干细胞的来源之一, 其支持证据主要有: (1)胃癌的好发部位与胃黏膜干细胞的分布部位相吻合; (2)胃黏膜干细胞与胃癌干细胞的体内生存微环境及体外培养条件相似[7] ; (3)两者共享相仿的信号通路[8]; (4)在胃的癌前病变肠化生组织中发现了胃黏膜干细胞。另外, 在生物学特点方面, 胃黏膜干细胞需要不断进行自我更新, 以维持干细胞池并替代衰老黏膜细胞, 其寿命较长, 接触致癌因子机会大、时间长, 恶变的概率更大。胃癌干细胞来源于骨髓源性干细胞的实验证据主要来自于Houghton等[9]的报道, 他们在小鼠骨髓接受致死剂量的放疗射线后, 移植具有半乳糖苷酶表达能力的转基因小鼠骨髓进行示踪, 并用幽门螺旋杆菌成功诱导了骨髓源性干细胞向胃癌干细胞的恶变。此外, 骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)具有抑制肿瘤细胞生长、调节肿瘤血管正常化和瘤灶趋化迁移等特点, 为胃癌干细胞来源于骨髓源性干细胞提供了新的旁证。 

终末分化细胞的干性重获是分化成熟细胞在各种理化因素刺激下, 其核内的基因表达发生改变, 干性基因被再激活, 从而使细胞再次获得干性特征。目前的相关研究主要集中在上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)方面。EMT是上皮细胞经历多重生物化学改变获得间质细胞表型的过程, 并伴随着干细胞表型及自我更新、化放疗耐受等特性的获得[10], 其信号通路中相关信号分子的改变也与干性相关信号分子相类似[11]。我们通过条件筛选联合化疗富集的方法分选出了胃癌SGC-7901 成球细胞, 进行干性鉴定后检测了干性相关蛋白SOX2、Oct4、Nanog 与间质标志物波形蛋白(vimentin)、基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)的表达, 初步确定了EMT 与干性特点的相关性, 这与Xue 等[1 2] 的研究结果类似。 

胃癌干细胞的特征及相关分选方法

胃癌干细胞的分选主要根据其与普通肿瘤细胞的差异性, 具体方法目前聚焦于胃癌干细胞特殊微环境、化疗耐药性、高侵袭转移性及特异性标志物等特点。

1. 干细胞微环境与条件培养筛选法: 干细胞微环境是具有维持干细胞干性能力的细胞生存环境,由细胞外基质、间质、血管及分泌因子等构成。目前, 对肿瘤干细胞微环境的研究主要集中在细胞间质和分泌因子如表皮生长因子(epidermal growthfactor, EGF)、碱性成纤维细胞生长因子(basicfibroblast growth factor , bFGF)、MMP、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor , VEGF)、骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein, BMP)等的分泌异常以及肿瘤血管异生等方面。在含有这些补充因子的环境中存活并维持其干性是肿瘤干细胞条件培养的依据。

无血清培养法是将细胞悬浮培养于无血清含补充因子的环境中, 通过肿瘤干细胞的增殖及非肿瘤干细胞的凋亡达到富集肿瘤干细胞目的的筛选方法[13]。我们通过补充因子种类的不同组合以及浓度调整, 确定了无血清悬浮培养胃癌干细胞的较适宜条件, 即在超低黏附无血清环境下, 补充20 ng /mlEGF、10 ng /ml bFGF、2% B27 和1% N-2, 可以使胃癌干细胞短期内悬浮成规则球体, 稳定传代。干性鉴定结果验证了该实验方法在胃癌细胞系中的可行性和可靠性。但存在的问题也较明显, 即富集效率不高。尽管我们进行了化疗药物的再纯化, 但成球细胞的干性相关蛋白(如SOX2、Oct-4 等)的表达仍然不能达到预期水平。这种类似天花板效应的实验结果可能与固定微环境中干细胞比例具有一定的稳定性有关。胃癌干细胞微环境的具体组成和调控仍然是进一步阐明干性相关机制的重点和难点。

 2. 特异性标志物与流式筛选法: 由于基因选择性表达和蛋白功能的差异, 异质性肿瘤细胞在肿瘤的产生、耐药和转移方面有着不同的作用, 且大多数具有特异性膜蛋白, 可将其与其他细胞亚群分别开来。然而, 在肿瘤干细胞的分选和鉴定中, 肿瘤干细胞相关标志物的研究和确定并不顺利。到目前为止, 相继报道的胃癌干细胞标志物有CD44、CD44 /CD24、CD44 /CD54、CD44 /EpCAM、CD90 、CD71、ALDH1、ABCG2、ABCB1 等[8] 。尽管它们所代表的胃癌干细胞来源不一, 在细胞群体中所占比例不同,小鼠体内成瘤的细胞数有差异, 但是大部分都具有自我更新和分化为异质性肿瘤细胞的能力, 即这些胃癌干细胞中的大部分都符合目前对于肿瘤干细胞的共识定义[3]。因此, 有人提出肿瘤干细胞的定义应该更加苛刻地具体到单个细胞的体内成瘤能力,但这在具体的操作过程中难以实现。尽管如此, 我们认为, 这可以通过体内注射单个细胞培养的悬浮球体来达到实验要求。无论如何, 根据近年来的相关研究结果, 我们认为肿瘤干细胞定义的重新厘定是有必要的。

 从目前研究的胃癌标志物来看, CD44 主要参与胃癌细胞的异质性黏附, 可能与胃癌的转移相关;EpCAM 主要参与上皮间黏附, 可能与上皮的癌变和胃癌的发生相关; CD90、ALDH1 参与胃黏膜干细胞的分化, 在正常胃黏膜干细胞中也有表达; ABCG2和ABCB1 属于细胞转运蛋白家族成员, 与胃癌的耐药相关。尽管在不同的研究中, 它们都具备胃癌干细胞几乎所有的干性特点, 但所研究的标志物似乎更偏向于胃癌干细胞干性中的其中一种或两种。因此, 我们认为在这些标志物所代表的胃癌干细胞的上端, 可能存在处于分化金字塔更顶端的胃癌干细胞, 这可能类似造血系统中的造血干细胞和定向祖细胞的关系。从这个角度上来看, 胃癌起始细胞可能更接近胃癌干细胞的本质, 即如前所述的单细胞致瘤能力。这需要更加严谨的科学实验去探讨。

 3. 化疗耐受与侧群(side population, SP)分选法: 肿瘤耐药是其难以根治且容易复发的重要原因,其耐药机制主要涉及细胞表面药泵蛋白的外排作用、药物修饰、细胞内解毒系统活化、凋亡信号通路阻滞和DNA 修复异常等[1 4] , 其中细胞表面药泵蛋白的外排作用被认为是肿瘤耐药性产生的最主要机制[15]。目前的研究表明, 肿瘤干细胞表面存在的ABCB1 和ABCG2 等ABC 转运体介导了毒性药物的外排过程。根据这一特性, Kondo 等[16]首先利用ABC 转运体外排核染料Hoechst33342 的特点, 从小鼠胶质瘤细胞系C6 中分选出了具有干细胞特性的SP 细胞。其后SP 分选法在结直肠癌、乳腺癌和胃癌等肿瘤干细胞分选中被广泛应用。

 相对于其他肿瘤干细胞分选方法来讲, SP 分选法是利用肿瘤干细胞的外排染料特性而进行的功能分选, 尽管其过程方便快捷, 但该方法却存在两个先天性的缺陷。首先, ABC 转运体对核染料Hoechst33342 的外排过程是一个动态的过程, 被泵出的核染料势必会再次进入细胞, 尽管在实验过程中利用维拉帕米(verapamil)对转运泵进行抑制对照, 但却不能保证分选出SP 细胞的纯度, 这不仅会对肿瘤干细胞分化及耐药实验结果产生偏差, 也会影响到肿瘤干细胞表面标志物的鉴定。其次, 分选出的SP 细胞可以认为是耐药细胞, 这与肿瘤干细胞的概念并不等同。一方面, 耐药细胞并不一定都是肿瘤干细胞, 这在结直肠癌和胃癌中已经得到了证实[17-18] ,利用SP 方法分选出的SP 细胞并不具备干性。另一方面, 对于肿瘤干细胞耐药的问题尚未形成定论, 如果处于未分化期的肿瘤干细胞都具有耐药特性的话, 这与临床上低分化肿瘤(如精原细胞瘤、小细胞肺癌等)对化疗敏感的临床事实相悖。这些都是SP分选肿瘤干细胞所遇到的、尚不能得到解释的问题。尽管SP 分选肿瘤干细胞的方法面临诸多的挑战, 但在肿瘤干细胞表面标志物不明确的情况下, 这种基于耐药特性的功能分选不失为一种较方便的分选方法, 当然, 所分选出的SP 细胞应该得到进一步的纯化和干性再鉴定。

 4. 高效转移与大网膜乳斑分选法: 大网膜乳斑是大网膜上一种特殊的淋巴样组织, 属于机体免疫系统的组成部分, 参与机体免疫应答、吞噬外来异物、生成血细胞和清除肿瘤转移灶等过程, 该部位与胃癌的腹腔种植转移相关[19], 即胃癌细胞突破浆膜层后会特异性种植到大网膜乳斑上面。根据EMT产生肿瘤干细胞并导致肿瘤转移的观点, 在胃癌发生转移的过程中, 有相当一部分胃癌干细胞转移到了大网膜乳斑上。因此, 从胃癌宿主的大网膜乳斑中筛选胃癌干细胞存在着一定的理论依据。Cao等[20]将鼠胃癌细胞株MFC 种植入小鼠腹腔, 72 h后取出小鼠大网膜, 收集大网膜乳斑上胃癌细胞团后进行干性鉴定, 结果显示, 在大网膜乳斑中确实存在胃癌干细胞。

 大网膜乳斑分选胃癌干细胞的方法利用了胃癌干细胞参与肿瘤转移的特点, 并选择了大网膜乳斑作为胃癌干细胞的天然滤器, 为胃癌干细胞的分选提供了新的思路, 但仍存在一些相互矛盾的论点。胃癌细胞在转移的过程中存在上皮性标志的缺失和间质特性的获得, 从而使之侵袭力增加并发生转移,当胃癌细胞到达转移灶后, 会发生间质上皮转化(mesenchymal-epithelial transition, MET), 表现为上皮性质的重获, 为胃癌细胞在转移灶中的锚定提供结构基础, 这在胃癌淋巴结转移灶中上皮标志物的重获和间质标志物的下调中得到过验证[21]。但在该过程中伴随着胃癌干细胞干性的脱落, 这与其分选方法的理论依据相违背, 其现实意义可能需要更为严谨的理论依据来支持。

 胃癌干细胞的鉴定与治疗策略

 胃癌干细胞的鉴定即对所获取的细胞进行干性鉴定, 包括悬浮成球实验检测自我更新能力、血清分化实验检测多向分化能力、平板克隆实验检测集落形成能力、侵袭实验检测转移能力、化疗耐受实验检测耐药能力、裸鼠成瘤实验检测体内致瘤能力以及干性相关蛋白(如SOX2、Oct-4、Nanog 等)的检测。目前, 这些鉴定方法已被大多数同行所认可, 并认定为肿瘤干细胞的标准鉴定程序。基于胃癌干细胞存在的事实、分选方法的持续改进和鉴定实验的不断完善, 寻找靶向胃癌干细胞药物已成为学者们关注的另一热点。目前, 诸多针对胃癌干细胞的药物已经进入基础和临床研究, 尽管它们的作用机制各异,但其作用目的不外乎两类, 即杀灭胃癌干细胞本身和消除胃癌干细胞的干性。杀灭胃癌干细胞是指利用胃癌干细胞特有的特性(如特异性表面标志物、化疗耐药等)作为靶点, 旨在清空胃癌干细胞池以达到根治胃癌目的的方法。该类方法主要有: (1)靶向胃癌干细胞表面标志物; (2)载体靶向治疗;(3)细胞周期激活; (4)抗端粒酶治疗; (5)调整干细胞微环境及抑制血管生成; (6)基因治疗。以消除胃癌干细胞干性为目标的治疗方法主要有: (1)靶向自我更新信号通路(如Shh、Notch、Wnt / β-catenin、BMP 等); (2)诱导分化治疗; (3)逆转耐药治疗; (4)靶向孤儿受体治疗。我们曾采用分化诱导剂全反式维甲酸对胃癌SGC-7901 干细胞进行诱导分化, 发现分化后胃癌干细胞干性标志物表达下降, 裸鼠成瘤能力降低, 氟尿嘧啶对分化后细胞的抑制率增加。因此, 我们有理由相信, 胃癌干细胞的靶向治疗将对胃癌的治疗提供新的选择。

 根据目前的相关研究可以确定, 人胃癌组织中确实存在这样一类胃癌细胞亚群, 它们较其他胃癌细胞具有更强大的体内致瘤能力, 并可以产生其他胃癌细胞亚群, 同时它们具有对化疗药物抵抗的特性[6 , 22]。然而, 不同实验室对这类细胞亚群的确定却因为表面标志物的差异而未能达成共识, 其所分离出的胃癌干细胞都符合肿瘤干细胞的共识定义,这提示关于肿瘤干细胞的定义及金标准实验可能需要进一步更新和细化。其次, 胃癌干细胞的来源、耐药的原因及细胞周期是否沉默等问题仍存在诸多的争议。所以, 胃癌干细胞从实验室的分离证实到临床的靶向清除, 可能还需要很长的时间。尽管如此,胃癌干细胞的分离和鉴定为胃癌的内科治疗提供了一个全新的思考领域, 也为晚期胃癌的根治提供了更为广阔的遐想空间。各类体外作用于胃癌干细胞的化学药物为靶向胃癌干细胞的治疗策略提供了良好的应用前景, 将靶向胃癌干细胞的药物与作用于普通胃癌细胞的细胞毒药物联合, 从而达到同时清除胃癌干细胞和瘤体的目的, 这可能是今后胃癌内科治疗的主要方向。

参考文献略

(收稿日期: 2013-09-22)