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临床研究
放化疗对鼻咽癌患者外周血髓源性抑制细胞和调节性T细胞的影响
中华肿瘤杂志, 2017,39(08): 579-583. DOI: 10.3760/cma.j.issn.0253-3766.2017.08.004
摘要
目的

探讨放化疗对鼻咽癌患者外周血髓源性抑制细胞(MDSC)和调节性T细胞(Treg)的影响,及其与放射性口腔黏膜炎的关系。

方法

选择2012年9月1日至2015年12月1日间进行放疗及同期放化疗的初治鼻咽癌患者60例,健康对照者20例。采用流式细胞术检测患者治疗前、放疗40 Gy、放疗结束和放疗后3个月外周血HLA-DRCD11bCD33MDSC、CD4CD25CD127low/-Treg的水平。同时比较放疗结束时发生0~Ⅱ级和Ⅲ~Ⅳ级放射性口腔黏膜炎患者的HLA-DRCD11bCD33MDSC和CD4CD25CD127low/-Treg水平。

结果

鼻咽癌患者治疗前、放疗40 Gy、放疗结束和放疗后3个月的外周血CD4CD25CD127low/-Treg水平分别为(8.42±1.52)%、(9.10±1.57)%、(8.87±1.56) %和(7.31±1.43)%,放疗40 Gy、放疗结束和放疗后3个月与治疗前比较,差异均有统计学意义(均P<0.05)。治疗前Ⅰ~Ⅱ期和Ⅲ~Ⅳ期患者外周血CD4CD25CD127low/-Treg水平分别为(7.65±1.94)%和(8.63±1.39)%,差异有统计学意义(P=0.042)。鼻咽癌患者治疗前、放疗40 Gy、放疗结束和放疗后3个月的外周血HLA-DRCD11bCD33MDSC水平分别为(2.14±1.21)%、(4.08±1.90)%、(3.76±1.31)%和(1.52±0.88)%,放疗40 Gy、放疗后3个月与治疗前比较,差异有统计学意义(均P<0.05)。Ⅰ~Ⅱ期和Ⅲ~Ⅳ期患者外周血HLA-DRCD11bCD33MDSC水平分别为(1.35±0.66)%和(2.25±1.26)%,差异有统计学意义(P=0.007)。放疗结束时,0~Ⅱ级和Ⅲ~Ⅳ级放射性口腔黏膜炎患者外周血HLA-DRCD11bCD33MDSC水平分别为(3.15±1.04)%和(4.41±1.27)%,差异有统计学意义(P=0.012)。0~Ⅱ级和Ⅲ~Ⅳ级放射性口腔黏膜炎患者外周血CD4CD25CD127low/-Treg水平分别为(8.41±1.52)%和(9.91±1.23)%,差异有统计学意义(P=0.02)。

结论

初治鼻咽癌患者外周血HLA-DRCD11bCD33MDSC、CD4CD25CD127low/-Treg的水平高于健康对照者,且与鼻咽癌分期有关。鼻咽癌单纯放疗及同期放化疗过程中,HLA-DRCD11bCD33MDSC和CD4CD25CD127low/-Treg水平明显增高,患者机体免疫能力下降,与治疗导致的放射性口腔黏膜炎有关。

引用本文: 戴夕超, 刘丽琴, 汪步海, 等.  放化疗对鼻咽癌患者外周血髓源性抑制细胞和调节性T细胞的影响 [J]. 中华肿瘤杂志,2017,39( 8 ): 579-583. DOI: 10.3760/cma.j.issn.0253-3766.2017.08.004
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鼻咽癌主要在中国的华南地区高发,主要治疗手段是放化疗,其发生发展与机体免疫功能改变和EB病毒感染有直接关系[1]。已有的研究显示,鼻咽癌患者除有外周血和肿瘤组织中CD4T细胞和细胞毒性T细胞数量减少、 CD4/CD8比值降低[1],尚伴有CD4CD25调节性T细胞(regulated T cells, Treg)的升高[2]和髓源性抑制细胞(myeloid-derived suppressor cells, MDSC)的改变[3,4]。越来越多的研究显示,放化疗除了直接的细胞毒性作用外,还可影响肿瘤局部微环境,进而调节机体免疫能力[5]。本研究中,我们通过流式细胞术检测初治鼻咽癌患者单纯放疗和同期放化疗治疗过程中Treg和MDSC水平的变化,探讨放化疗对鼻咽癌患者细胞免疫功能的影响。

资料与方法
1.患者资料:

选择2012年9月1日至2015年12月1日间在我院进行单纯放疗及同期放化疗的60例初治鼻咽癌患者,均经MRI、CT和鼻咽镜活检病理检查确诊。其中男性45例,女性15例。年龄28~67岁,平均年龄49.6岁。按照中国鼻咽癌2008年分期标准,Ⅰ~Ⅱ期13例,Ⅲ~Ⅳ期47例。同期放化疗48例,单纯放疗12例。在放疗前、放疗结束和放疗后3个月均行MRI检查评价病情。另设健康对照组20例。本研究经我院伦理委员会批准(20140623),患者及健康对照者均签署知情同意书。

2.试剂:

Anti-human-HLA-DR-APC、Anti-human-CD11b-FITC、Anti-human-CD33-PE、Anti-human-CD4-Percp-Cy-5、Anti-human-CD25-FITC、Anti-human-CD127-PE和同型对照IgG-APC、IgG-FITC、IgG-PE、IgG-Percp-Cy-5均为美国BD公司的产品。

3.治疗方法:

(1)放疗:采用调强适形放射治疗(intensity-modulated radiation therapy,IMRT),根据《肿瘤放射治疗学》第4版鼻咽癌治疗原则进行靶区勾画,其中T1、T2期患者的大体肿瘤体积(gross tumor volume,GTV)为2.2 Gy/次,30次;T3、T4期患者的GTV为2.2 Gy/次,32次;高危区总量60 Gy,低危区总量54 Gy。(2)同期放化疗:在放疗第1天开始化疗,方案为:紫杉醇135~175 mg/m2或多西紫杉醇60~80 mg/m2,静脉滴注,第1、8天;顺铂或奈达铂25 mg/m2,静脉滴注,第1~3天。21 d重复1次,共进行2次同期化疗。疗效评价按照实体瘤疗效评价标准1.1版[6],分为完全缓解(complete response, CR)、部分缓解(partial response, PR)、疾病稳定(stable disease, SD)和疾病进展(progressive disease, PD)。不良反应根据美国肿瘤放射治疗协作组织放射性不良反应分级标准,分为0~Ⅳ级[7]

4.标本收集:

抽取患者治疗前、放疗40 Gy、放疗结束、放疗后3个月的清晨空腹静脉血2 ml,健康对照者在体检当日清晨抽取空腹血2 ml。所有血标本以EDTA-Na2抗凝。

5.流式细胞术:

取荧光标记的抗体各20 μl,加入流式管,再加入抗凝血100 μl,混合均匀,室温下反应30 min。加入红细胞裂解液,振荡混匀,37℃恒温箱中放置10 min至液体透亮,1 200 r/min离心5 min,离心半径15 cm,弃上清。磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline,PBS)洗涤1次,1 200 r/min离心5 min,离心半径15 cm,弃上清。加入0.5 ml PBS重悬,上流式细胞仪(BD Cantoll型)检测。检测免疫细胞数2×105个,CD4CD25CD127low/-Treg水平为CD4CD25CD127low/-细胞占CD4细胞的比例,HLA-DRCD11bCD33MDSC水平为HLA-DRCD11bCD33细胞占单个核细胞的比例。

6.统计学方法:

采用SPSS 18.0软件进行统计分析,正态分布的计量资料采用t检验,不符合正态分布的计量资料采用非参数检验。检验水准α=0.05。

结 果
1.疗效:

60例初治鼻咽癌患者中,放疗结束时,CR 48例,PR 9例,SD 2例,PD 1例。放疗后3个月,CR 51例,PR 7例,SD 1例,PD 1例。放疗结束时,发生0~Ⅱ级放射性口腔黏膜炎25例,Ⅲ~Ⅳ级放射性口腔黏膜炎35例。

2.放化疗对鼻咽癌患者外周血Treg的影响:

治疗前,鼻咽癌患者外周血CD4CD25CD127low/-Treg水平为(8.42±1.52)%,高于健康对照组的(7.50±1.62)%,差异有统计学意义(t=2.263,P=0.026);Ⅰ~Ⅱ期和Ⅲ~Ⅳ期患者外周血CD4CD25CD127low/-Treg水平分别为(7.65±1.94)%和(8.63±1.39)%,差异有统计学意义(t=-2.076,P=0.042);Ⅰ~Ⅱ期患者与健康对照组的差异无统计学意义(t=0.234,P=0.816 )。放疗40 Gy时,鼻咽癌患者外周血CD4CD25 CD127low/-Treg水平为(9.10±1.57)%,较治疗前明显升高(t=-3.576,P=0.011)。放疗结束时,CD4CD25CD127low/-Treg水平为(8.87±1.56)%,较放疗40 Gy时稍有下降(t=2.014,P=0.049),但仍高于治疗前(t=-2.417,P=0.019)。放疗后3个月,鼻咽癌患者外周血CD4CD25CD127low/- Treg水平为(7.31±1.43)%,低于治疗前,差异有统计学意义(t=6.934,P=0.01),与健康对照组差异无统计学意义(P=0.62,图1)。

图1
鼻咽癌患者治疗过程中外周血CD4CD25CD127low/- Treg的流式图(CD4 门) A:治疗前;B:放疗40 Gy; C:放疗结束;D:放疗后3个月;E:健康对照组
图1
鼻咽癌患者治疗过程中外周血CD4CD25CD127low/- Treg的流式图(CD4 门) A:治疗前;B:放疗40 Gy; C:放疗结束;D:放疗后3个月;E:健康对照组
3.放化疗对鼻咽癌患者外周血MDSC的影响:

治疗前,鼻咽癌患者外周血HLA-DRCD11bCD33MDSC水平为(2.14±1.21)%,高于健康对照组的(1.08±0.48)%,差异有统计学意义(t=5.534,P=0.01);Ⅰ~Ⅱ期和Ⅲ~Ⅳ期患者外周血HLA-DRCD11bCD33MDSC水平分别为(1.35±0.66)%和(2.25±1.26)%,差异有统计学意义(t=3.869,P=0.007);Ⅰ~Ⅱ期患者和健康对照组的差异无统计学意义(P>0.05)。在放疗40 Gy时,鼻咽癌患者外周血HLA-DRCD11bCD33MDSC水平为(4.08±1.90)%,与治疗前差异有统计学意义(t=-12.889, P=0.034)。放疗结束时,鼻咽癌患者HLA-DRCD11bCD33MDSC水平为(3.76±1.31)%,与放疗40 Gy时的差异无统计学意义(P>0.05)。放疗后3个月,鼻咽癌患者外周血HLA-DRCD11bCD33MDSC水平为(1.52±0.88)%,与治疗前差异有统计学意义(t=3.618, P=0.001;图2)。

图2
鼻咽癌患者治疗过程中外周血HLA-DRCD11bCD33MDSC的流式图(HLA-DR 门) A:治疗前;B:放疗40 Gy; C:放疗结束;D:放疗后3个月;E:健康对照组
图2
鼻咽癌患者治疗过程中外周血HLA-DRCD11bCD33MDSC的流式图(HLA-DR 门) A:治疗前;B:放疗40 Gy; C:放疗结束;D:放疗后3个月;E:健康对照组
4.不同级别放射性口腔黏膜炎患者外周血MDSC和Treg水平:

放疗结束时,0~Ⅱ级和Ⅲ~Ⅳ级放射性口腔黏膜炎患者外周血HLA-DRCD11bCD33MDSC水平分别为(3.15±1.04)%和(4.41±1.27)%,差异有统计学意义(t=4.252, P=0.012)。0~Ⅱ级和Ⅲ~Ⅳ级放射性口腔黏膜炎患者外周血CD4CD25CD127low/-Treg水平分别为(8.41±1.52)%和(9.91±1.23)%,差异有统计学意义(t=4.164, P=0.02)。

讨 论

鼻咽癌在中国华南地区高发,60%~70%的患者在发现时即为Ⅲ~Ⅳ期,其标准的治疗方法是放疗及同期放化疗[8]。但经标准治疗后,仍有一部分鼻咽癌患者出现复发转移,可能与患者的机体免疫功能降低有关[9,10]。因此,探讨鼻咽癌治疗过程中机体免疫功能的改变具有重要意义。

Treg在炎症及肿瘤免疫逃逸中发挥免疫抑制作用,人类Treg细胞为CD4CD25high+T细胞群,已经得到公认[11]。目前的研究显示,CD4CD25high+CD127low/-T细胞是较CD4CD25high+Foxp3T细胞更具代表性的Treg特异性表面分子标志[12]。MDSC是一组高度异质性、具有免疫抑制功能的细胞群,是近年来研究的热点。人类MDSC通常被定义为表达髓系标记分子CD33、但是缺乏表达成熟髓系细胞或者淋巴样细胞的表面标志以及缺乏表达主要组织相容性复合体Ⅱ类(major histocompatibility complex Ⅱ,MHC Ⅱ)分子人类白细胞抗原DR(human leukocyte antigen DR,HLA-DR)的细胞群。MDSC可通过促进Treg的成长间接发挥免疫抑制功能,同时MDSC具有很强的抑制CD4和CD8T细胞功能发挥的作用,影响机体免疫能力[13]。因此,Treg、MDSC在肿瘤免疫逃逸及炎症中发挥重要作用,它们之间相互影响,可作为判断机体细胞免疫能力的指标。

本研究中,在治疗前,鼻咽癌患者外周血CD4CD25CD127low/-Treg和HLA-DRCD33CD11bMDSC水平高于健康对照者,而早期(Ⅰ~Ⅱ期)患者与健康对照者差异较小,Ⅲ~Ⅳ期患者明显高于Ⅰ~Ⅱ期患者,差异有统计学意义。2006年,刘莉等[14]研究显示,鼻咽癌患者外周血CD4CD25Treg水平升高;汪铁军等[15]和Lau等[2]研究显示,初治鼻咽癌患者治疗前CD4CD25high+ Treg水平明显高于正常人,但均未说明其与肿瘤分期的关系。而对于鼻咽癌患者外周血MDSC的研究更加鲜见。2015年,有研究显示,鼻咽癌患者外周血中HLA-DRCD33CD11bMDSC水平高于正常人群,且与肿瘤分期明显相关,说明MDSC、Treg与鼻咽癌的发生、发展有关[3,4]

本研究中,我们观察了鼻咽癌患者放化疗过程中外周血CD4CD25CD127low/-Treg、HLA-DRCD33CD11bMDSC的动态变化,结果显示,在放疗40 Gy和放疗结束时,CD4CD25CD127low/-Treg、HLA-DRCD33CD11bMDSC水平却较治疗前明显升高,患者机体免疫能力下降。而此时MRI检查显示,大部分肿瘤治疗后均缩小,达到缓解,理论上肿瘤负荷减少,机体免疫能力应得到提高,Treg和MDSC水平应下降。刘莉等[14]的研究也显示,鼻咽癌患者放疗结束时外周血Treg水平明显高于放疗前,其推测可能是放射性损伤导致了Treg的升高,但未予证实。而聂明等[16]的研究亦显示,放疗前鼻咽癌患者外周血CD4CD25Treg水平升高,放疗结束后6个月有所下降。

鼻咽癌患者放疗后放射性口腔黏膜炎的发生率达80%~90%,而Ⅲ~Ⅳ级放射性口腔黏膜炎的发生率可达50%[17],加用同期化疗后的发生率更高。本研究中,我们比较了放疗结束时发生0~Ⅱ级和Ⅲ~Ⅳ级放射性口腔黏膜炎患者外周血中HLA-DRCD33CD11bMDSC和CD4CD25CD127low/-Treg水平。结果显示,Ⅲ~Ⅳ级放射性口腔黏膜炎患者的HLA-DRCD33CD11bMDSC和CD4CD25CD127low/-Treg水平明显升高,差异有统计学意义。我们推断,放射性口腔黏膜炎导致了鼻咽癌患者单纯放疗及同期放化疗过程中HLA-DRCD33CD11bMDSC和CD4CD25CD127low/-Treg水平的升高,患者机体免疫力下降。而在放疗后3个月,随着放射性炎症的痊愈和肿瘤负荷的明显减低,HLA-DRCD33CD11bMDSC和CD4CD25CD127low/-Treg水平较治疗前明显下降,差异有统计学意义,其中CD4CD25CD127low/-Treg水平与健康对照组相似,而HLA-DRCD33CD11bMDSC水平仍稍高于健康对照组。

本研究结果表明,初治鼻咽癌患者外周血CD4CD25CD127low/-Treg和HLA-DRCD33CD11bMDSC水平较正常人群高,且与鼻咽癌分期有关。鼻咽癌患者放疗及同期放化疗过程中,CD4CD25CD127low/-Treg和HLA-DRCD33CD11bMDSC水平明显增高,患者机体免疫能力下降,与治疗导致的放射性损伤如放射性口腔黏膜炎有关。

本研究的缺点是样本数不够大,在后续的研究中,可扩大样本进一步确认研究结果。同时可考虑设计随机对照前瞻性研究,在鼻咽癌放化疗过程中使用免疫调节剂,监测鼻咽癌患者机体免疫能力的改变与预后的关系。

利益冲突

利益冲突 无

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关键词
主题词
鼻咽肿瘤
调节性T细胞
髓源性抑制细胞
细胞免疫能力
放射性口腔黏膜炎