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临床研究
高通量靶向基因测序技术探查食管癌放射敏感性相关基因
中华肿瘤杂志, 2017,39(08): 584-588. DOI: 10.3760/cma.j.issn.0253-3766.2017.08.005
摘要
目的

通过高通量靶向基因检测(TPS)技术探查与食管癌放射敏感性相关的基因。

方法

收集22例单纯放疗的食管癌患者外周血,提取DNA,利用Haloplex方法对356种已知恶性肿瘤相关基因进行文库捕获,基于Illumina MiSeq技术平台进行TPS,测序数据进行单核苷酸多态性/插入缺失标记(SNP/InDel)位点数据库注释和通路富集分析。将22例患者根据放疗近期疗效分为放射敏感组(CR+PR)和放射抗拒组(PD+SD),对其中的非同义突变位点进行统计分析,筛选与食管癌放射敏感性相关基因。

结果

22例患者的测序数据中,97%以上的reads与人类基因组序列相匹配,数据相当可靠。SNP/InDel数据库注释结果显示,22例患者的突变位点主要分布在外显子区域,其对应的功能分布主要为错义与同义单核苷酸变异(SNV)。进一步筛选出与食管癌相关的高频突变基因有23个。IPA通路富集结果显示,与食管癌发生发展相关的通路有3条,分别为BRCA1基因相关的DNA修复通路、DNA双链断裂修复的非同源末端连接修复通路和ATM信号通路。根据放疗疗效筛选出与食管癌放射敏感性相关的基因分别为错配修复基因蛋白1(PMS1)、纤维连接蛋白1(FN1)、MLH1、鼠类肉瘤滤过性毒菌致癌同源体B1(BRAF)、人类同源的果蝇片段基因1(PTCH1)和CYP2C19。进一步统计分析显示,PTCH1在22例患者中均有突变,其中rs199476092和rs202111971突变位点仅见于放射抗拒组。

结论

PTCH1基因编码区内rs199476092和rs202111971突变位点与食管癌患者的放射敏感性密切相关。

引用本文: 乔云, 胡晨曦, 宋大安, 等.  高通量靶向基因测序技术探查食管癌放射敏感性相关基因 [J]. 中华肿瘤杂志,2017,39( 8 ): 584-588. DOI: 10.3760/cma.j.issn.0253-3766.2017.08.005
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食管癌是侵袭性很强的恶性肿瘤,放疗是其主要治疗手段之一[1,2]。食管癌患者的放疗疗效千差万别,筛选与食管癌放疗疗效及预后相关的标志物具有重要意义。体细胞基因组分子改变的积累是癌症发展的基础[3],从分子层面深入了解与食管癌放射敏感性相关的基因,对提高放疗疗效至关重要。本研究中,我们以22例接受根治性单纯放疗的食管癌患者为研究对象,采用高通量靶向基因测序(target sequencing panel, TSP)技术,综合生物信息学,分析与食管癌放射敏感性相关的基因。

资料与方法
1.研究对象:

选取2014年6月至2015年5月间在我院放疗科就诊的22例食管癌患者,其治疗方式为单纯放疗,不限制患者的性别、年龄和肿瘤病理分期等。所有患者的病理类型均为鳞癌,均采取精确放疗。本研究经我院医学伦理委员会批准,所有患者均签署知情同意书。

2.DNA的提取和测序:

患者放疗开始前抽取外周静脉血5 ml,置于含乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid, EDTA)抗凝试管中。采用QIAamp DNA Mini Kit(德国Qiagen公司)提取DNA,然后构建Agilent HaloPlex目标区域捕获文库。应用Illumina Hiseq 2500高通量测序仪对测序文库的DNA样本进行测序分析,获取每个样品的生物学信息。

3.生物信息学分析:

首先将获得的生物学信息(有效数据)与参考基因组[4]进行去重复、局部重比对、碱基质量值重校正等处理,然后进行覆盖度的统计分析。将样品的最终比对结果(BAM文件)采用GATK的HaplotypeCaller模块进行单核苷酸多态性/插入缺失标记(SNP/InDel)检测。GATK检测得到的变异结果采用VCF格式文件存储,进一步采用ANNOVAR软件与UCSC数据库[5]、dbSNP数据库、千人基因组[4]计划数据库、外显子组测序计划数据库及AVSIFT数据库等进行比对,从而对变异位点对应的基因和功能进行注释、分析。进一步对在千人基因组计划中突变频率<1%的基因进行了IPA通路富集分析。

4.放射敏感性相关突变基因分析:

患者放疗结束后1个月行食管钡餐和胸部增强CT检查,评价放疗近期疗效。近期疗效评价采用任伟等[6]推荐的食管钡餐造影分级标准评估原发灶的疗效,采用实体瘤疗效评价标准评估转移淋巴结的疗效,分为完全缓解(complete response, CR)、部分缓解(partial response, PR)、疾病稳定(stable disease, SD)和病情进展(progression disease, PD)。根据疗效将患者分为放射敏感组(CR+PR)和放射抗拒组(SD+PD),对两组中非同义(错义变异+未知变异)的、且在千人基因组计划中突变频率<0.01的突变位点进行统计分析。

5.统计学方法:

采用SPSS 20.0软件进行统计分析。计数资料的比较采用χ2检验,两独立样本资料的比较采用Mann-Whitney U非参数检验。检验水准α=0.05。其中IPA通路富集分析的显著性标准为错误发现率(false discovery rate,FDR)<0.03。

结 果
1.一般临床资料:

22例食管癌患者中,放疗后达CR 6例,PR 9例,SD 5例,PD 2例。放射敏感15例,放射抗拒7例。其中放射敏感组患者的中位年龄为61岁,放射抗拒组患者的中位年龄为66岁,差异无统计学意义(P=0.352)。两组患者的基本临床病理特征见表1。22例患者均采用6 MV-X射线适形放疗或调强放疗,靶区勾画参照第4版肿瘤放射治疗学[7]与韩大力等[8]研究。计划靶区(planning target volume, PTV)处方剂量为2.0 Gy/次,1次/d,5次/周,共6周。计划评价要求95%PTV接受100%处方剂量照射,靶体积内的剂量均匀度为95%~105%的等剂量线范围内。双肺V20≤28%,肺平均剂量≤13 Gy,心脏V30≤40%,V40≤30%,脊髓≤45 Gy。

表1

放射敏感组和放射抗拒组食管鳞癌患者的一般临床资料(例)

表1

放射敏感组和放射抗拒组食管鳞癌患者的一般临床资料(例)

临床病理特征放射敏感组(n =15)放射抗拒组(n =7)χ2P
性别    
 男性950.2690.604
 女性62  
病变部位    
 颈段420.0080.927
 胸段115  
病变长度(cm)    
 ≤3.021  
 3.1~5.0110.3830.944
 5.1~7.031  
 >7.094  
临床分期    
 Ⅰ期21  
 Ⅱ期420.0160.992
 Ⅲ期94  
2.靶向基因测序质量评价:

本组22例DNA测序样品reads的比对率均>97%,即97%以上的reads与人类基因组序列相匹配,测序深度的覆盖深度比例均>95%,覆盖度均一性>90%,具体结果见表2

表2

22例食管癌患者的高通量测序质量分析结果

表2

22例食管癌患者的高通量测序质量分析结果

样品编号测序得到有效数据量(Mb)与人类基因组序列相匹配的比对率(%)目标区域平均测序深度测序深度>10×区域比例(%)测序深度>20×区域比例(%)
Eso-11 746.8697.80867.5396.4095.10
Eso-21 779.1797.90904.8096.5095.30
Eso-32 272.4397.901 144.4496.8095.90
Eso-41 742.8697.60854.5096.2095.00
Eso-52 183.6298.001 093.9297.0096.20
Eso-61 914.3897.80973.2096.6095.70
Eso-71 679.6897.70832.9596.3095.20
Eso-81 771.7297.70873.9796.5095.70
Eso-91 741.4297.90877.5496.8095.70
Eso-102 481.5897.701 236.3896.7096.00
Eso-111 855.8297.90938.2796.5095.40
Eso-122 218.7798.101 070.3496.5095.50
Eso-131 785.6697.80910.6696.6095.50
Eso-141 861.0297.70925.3796.3095.00
Eso-152 151.1297.901 096.4596.7095.80
Eso-162 004.4998.001 035.4896.5095.20
Eso-172 517.8797.901 255.3596.4095.20
Eso-181 810.6797.60876.7496.1095.00
Eso-191 964.9897.70933.4996.5095.40
Eso-201 856.6697.80928.1396.5095.50
Eso-211 971.4597.60948.8495.9094.50
Eso-221 613.6497.80796.4496.1094.60
3.单核苷酸变异及分型:

22例食管癌患者的突变位点主要分布在外显子(exon)区域(455.63±19.07),突变的位点主要为错义与同义单核苷酸变异(single-nucleotide variations,SNV)。22例食管癌患者的点突变中转换突变显著高于颠换突变(P=0.034),转换/颠换比值为2.3~3.3。其中突变类型最多的为C>T(207.95±9.3),其次为A>G(198.82±7.0)。

4.突变基因诊断结果:

筛选出22例食管癌患者样本中非同义的、并在千人基因组计划中突变频率<0.01的突变位点,其中与食管癌相关的高频突变(基因突变频率>0.35)基因有23个,其中胶质瘤相关癌基因2(glioma associated oncogene homolog,GLI2)、mut S同种组织蛋白2(mutS homolog 2,MSH2)、人类同源的果蝇片段基因1(human homolog of the drosophila patched 1,PTCH1)在22例食管癌患者中均有突变。GLI2、MSH2、PTCH1、KDM5C、SMARCA4、纤维连接蛋白1(fibronectin-1,FN1)、转染重排基因(rearranged during transfection,RET)和TP53INP1基因突变率分别为100.00%、100.00%、100.00%、95.45%、95.45%、90.91%、90.91%和90.91%。

5.IPA通路富集分析结果:

对22例食管癌患者样本中非同义突变、且在千人基因组计划中突变频率<1%的突变基因进行通路富集。其中与食管癌发生发展相关的通路有3条,分别为BRCA1基因相关的DNA修复通路(role of BRCA1 in DNA damage response)、DNA双链断裂修复的非同源末端连接修复通路(DNA double-strand break repair by non-homologous end joining)和ATM信号通路(ATM signaling)。

6.与食管癌放射敏感性相关的突变位点:

对放射敏感组和放射抗拒组患者中非同义的、且在千人基因组计划中突变频率<0.01的突变位点进行Mann-Whitney U检验,筛选出与放疗敏感性相关的突变位点及其对应的基因,结果见表3

表3

22例食管癌患者放射敏感性相关突变位点及基因

表3

22例食管癌患者放射敏感性相关突变位点及基因

突变位点对应基因P
chr2_190719186_.PMS10.010
chr2_216240126_rs71044591.FN10.034
chr3_37067240_rs63750447.MLH10.034
chr7_140434576_.BRAF0.034
chr9_98229479_rs199476092.PTCH10.034
chr9_98278972_rs202111971.PTCH10.034

注:PMS1:错配修复基因蛋白1; FN1:纤维连接蛋白1; BRAF:鼠类肉瘤滤过性毒菌致癌同源体B1; PTCH1:人类同源的果蝇片段基因1

讨 论

恶性肿瘤的发病机制一般是源自遗传的基因突变或获得性的体细胞突变。确定哪些突变有可能导致恶性肿瘤的表型变化是恶性肿瘤基因组测序研究的目的[3]。目前,寻找驱动突变最常用的方法是识别重复出现的、具有转化作用的突变位点(如错义、无义突变、剪切位点SNVs或编码区域缺失)。目前,放疗为食管癌的主要治疗手段之一,但食管癌患者个体间放疗反应存在很大差异,虽然不同的病理类型、肿瘤位置、临床分期等与患者放疗后的复发风险具有一定的相关性,但也不能将放疗敏感和不敏感的患者区别开来[9]。因此,探讨与食管癌患者放疗疗效相关的基因将有助于阐明遗传因素影响放疗反应的内在机制,对临床个体化治疗方案的制订具有重要意义。本研究中,我们采用的TPS技术具有高通量、高准确度、高灵敏度和检测成本低的优点,检测结果显示,22例食管癌患者的突变基因主要为错义与同义SNV。通过生物信息学分析显示,PTCH1基因编码区内rs199476092和rs202111971突变位点仅见于放射抗拒组。

本研究中,我们以22例接受根治性放疗的食管鳞癌患者为研究对象,通过TPS技术对DNA文库中富集的与恶性肿瘤发生发展相关的356种(共5 255种靶向突变位点)靶向基因进行了高通量测序分析。结果显示,22例患者的基因突变类型为点突变,主要为转换突变和颠换突变,其比值为2.3~3.3,说明食管癌患者发生的突变均为二等位多态性,转换型变异显著高于颠换型。我们对检测分析得到的SNP与InDel位点进行基因和功能注释,结果显示,突变位点主要分布在外显子内。进一步分析结果表明,突变位点主要为错义与同义SNV。SNV是恶性肿瘤细胞中特异的单核苷酸变异,是一种体细胞突变。Kennedy等[10]研究显示,基因多态性决定了个体的疾病易感性,而体细胞突变直接导致了疾病的发生发展。Watson等[11]研究显示,体细胞突变在肿瘤患者中具有多样性,并导致肿瘤发生发展过程中的差异;同时,体细胞突变虽然发生在同一个基因上,却分散在不同的位置,说明了体细胞发生的随机性。本研究中,我们进一步筛选出与食管癌相关的高频突变基因23个,其中GlI2、MSH2、PTCH1基因在22例食管癌患者中均有变异,提示这3种基因变异可能与食管癌的发生发展有重大关系。对23个基因通过通路富集,筛选富集结果最多的前20条通路。通过查阅文献,筛选出其中与食管癌发生发展可能相关的通路共3条,即BRCA1基因相关的DNA修复通路、DNA双链断裂修复的非同源末端连接修复通路和ATM信号通路。

本研究中,根据22例食管癌患者放疗疗效分为放射敏感组和放射抗拒组,筛选出其中的非同义变异位点对应的基因分别为PMS1、FN1、MLH1、BRAF、PTCH1和CYP2C19。其中PTCH1在22例患者中均有突变,但是rs199476092和rs202111971突变位点仅见于放射抗拒组(P=0.034)。

PTCH1基因是HH(Hedgehog)信号传导途径上的一个重要基因。有研究表明,HH在多种肿瘤的发生、分化、侵袭和转移中起关键性作用[12]。而功能性PTCH1等位基因的沉默是HH通路激活和肿瘤发生的关键,正常情况下,PTCH1基因对SMO(Smoothened)具有抑制作用,因此,有学者认为PTCH1是一种抑癌基因[13]。本研究中,PTCH1基因在22例食管癌患者中均有非同义变异,其编码区的rs199476092和rs202111971位点变异将导致食管癌患者产生放射抗拒性,致其放疗疗效较差。PTCH1突变后改变其基因功能,启动肿瘤细胞的分化和增殖,进而产生放射抗拒性,但其具体机制尚需进一步研究。

本研究中,我们通过高通量靶向分子基因检测技术(包括文库捕获、上机测序、数据分析、变异解释等),发现了PTCH1基因编码区内rs199476092和rs202111971突变位点与食管癌患者放射敏感性的关系,这将对指导患者个体化治疗具有重要意义。

利益冲突

利益冲突 无

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关键词
主题词
食管肿瘤
靶向基因测序
放射敏感性基因