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基础研究
盐酸埃克替尼和细胞因子诱导的杀伤细胞对肺腺癌细胞的体外杀伤作用研究
中华肿瘤杂志, 2017,39(08): 573-578. DOI: 10.3760/cma.j.issn.0253-3766.2017.08.003
摘要
目的

探讨盐酸埃克替尼(icotinib)和细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)对人肺腺癌细胞的体外抑制作用。

方法

采用CCK-8法检测icotinib和CIK对HCC827和A549细胞的抑制作用,应用Annexin V-FITC/PI双染法检测肿瘤细胞凋亡,流式细胞仪分析icotinib作用CIK表型的变化。

结果

1.5、3、6、12 μmol/L icotinib对HCC827细胞的抑制率分别为(5.64±0.05)%、(8.62±0.45)%、(14.57±0.65)%和(18.52±0.91)%,对A549细胞的抑制率分别为(1.64±0.48)%、(2.09±0.28)%、(3.69±0.45)%和(4.41±0.58)%。在相同浓度下,icotinib对HCC827细胞的抑制率明显高于A549细胞(P<0.05)。效靶比为10∶1、20∶1、40∶1时,CIK对HCC827细胞的抑制率分别为(15.17±2.33)%、(42.59±7.18)%和(62.59±8.95)%,对A549细胞的抑制率分别为(16.99±2.81)%、(46.31±1.89)%和(58.24±4.23)%,相同效靶比的CIK对HCC827和A549细胞的抑制率差异无统计学意义(P10∶1=0.299,P20∶1=0.318,P40∶1=0.366)。6 μmol/L icotinib联合CIK后,在10∶1、20∶1、40∶1效靶比下,对HCC827细胞的抑制率分别为(37.07±3.50)%、(76.03±6.55)%和(80.34±10.69)%,对A549细胞的抑制率分别为(25.72±1.41)%、(52.76±3.82)%和(62.26±1.94)%,除6 μmol/L icotinib+40∶1 CIK组与40∶1 CIK组对A549细胞的抑制率差异无统计学意义外(P=0.089),其他各联合组对肿瘤细胞的抑制率明显高于icotinib组和相同效靶比下CIK组(P<0.05),且联合组CI值均<1。联合组的HCC827和A549细胞凋亡率明显高于icotinib组和空白对照组(P<0.05),晚期凋亡或坏死细胞比例显著上升,随着CIK效靶比的升高,其抑制作用更强(P<0.05)。icotinib作用前后的CIK表型表达率差异无统计学意义(P>0.05)。

结论

icotinib对表皮生长因子受体(EGFR)突变型肺腺癌细胞更敏感,而EGFR突变状态对CIK细胞的杀伤作用无影响。icotinib联合CIK对肿瘤细胞的抑制作用更强,两者具有协同作用,且icotinib对CIK细胞的表型无影响。

引用本文: 姚冰清, 贾原, 郭继强, 等.  盐酸埃克替尼和细胞因子诱导的杀伤细胞对肺腺癌细胞的体外杀伤作用研究 [J]. 中华肿瘤杂志,2017,39( 8 ): 573-578. DOI: 10.3760/cma.j.issn.0253-3766.2017.08.003
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目前,在全球范围内,肺癌是引起肿瘤相关死亡的首位原因[1]。而在我国,肺癌的发病率和死亡率高居榜首,并呈现出逐年上升趋势,严重危害着人类健康[2]。由于化疗、放疗等传统治疗模式的毒副反应,其对肿瘤患者生存时间和生活质量的改善较难有所突破,亟待探索和建立新的治疗方案。随着对肿瘤驱动基因的深入研究,表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(epidermal growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitor, EGFR-TKI)已在肺癌的治疗中广泛应用,具有疗效确切、不良反应小和口服用药方便的优点[3],但也有部分患者发生获得性耐药,出现病情进展。EGFR-TKI的耐药机制十分复杂,治疗策略也在积极探索中[4]。肿瘤免疫生物治疗是一种新兴的肿瘤治疗模式,可通过激发或调动机体免疫反应,提高机体的抗肿瘤能力。其中应用较为成熟的细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine induced killer, CIK),是以CD3CD56T细胞为主要效应细胞的异质细胞群,具有增殖率高、杀瘤谱广和杀伤活性高的特点[5]。有研究表明,化疗药物可以增强肿瘤的免疫原性,活化抗肿瘤免疫应答,对其后的免疫治疗有增效作用[6,7]。为探讨靶向治疗联合生物免疫治疗能否提高机体对肿瘤的杀伤作用,我们分析了盐酸埃克替尼(icotinib)与CIK联合作用肺腺癌细胞的协同杀伤作用,为靶向治疗与生物免疫治疗的临床联合应用提供基础理论支持。

材料与方法
一、材料

icotinib由浙江贝达药业有限公司惠赠,纯度99.96%,由RPMI-1640配置。人肺腺癌A549细胞(EGFR野生型)和人肺腺癌HCC827细胞(EGFR突变型)为山西大医院生物治疗实验室保存的传代细胞系。改良型RPMI-1640培养基购自美国Scientific公司,胎牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司,淋巴细胞分离液购自天津灏洋生物制品科技有限责任公司,CD3McAb购自美国eBioscience公司,重组人白介素2(recombinant human interleukin-2, rhIL-2)、重组人干扰素γ(recombinant human interferon-γ,rhIFN-γ)购自北京四环生物制药有限公司,细胞计数试剂盒-8(cell counting kit-8, CCK-8)购自日本Dojido公司,Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司,CD3-PerCP-CY5.5、CD4-FITC、CD8-APC、CD56-PE、CD28-PE、CD25-APC、CD127-PE和流式细胞仪购自美国BD公司。

二、实验方法
1.CIK细胞的制备:

采集健康志愿者外周血20 ml,肝素抗凝,1 600 r/min离心8 min,移除血清。加入淋巴细胞分离液,2 000 r/min离心16 min,分离外周血单个核细胞。PBS洗涤2次,RPMI-1640培养液30 ml重悬细胞,接种于75 cm2细胞培养瓶中。加入rhIL-2、IFN-γ和庆大霉素注射液,置于37℃、5% CO2培养箱中培养4 h。收集悬浮细胞,接种于75 cm2细胞培养瓶中,补充RPMI-1640至50 ml,置于37℃、5% CO2培养箱中培养。培养第2天,细胞转移入已包被CD3McAb 10 μl的培养瓶中,每2 d半量换液。培养至第7天时,收获CIK备用。

2.CCK-8法检测icotinib对HCC827和A549细胞增殖的抑制作用:

取对数生长期的HCC827和A549细胞,接种于96孔板中,104个/孔。用含0.1%胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)的RPMI-1640培养,贴壁后弃上清。实验分为icotinib组和空白对照组,icotinib组中icotinib的浓度梯度设置为1.5、3、6、12 μmol/L(100 μl /孔),空白对照组每孔加入RPMI-1640培养液100 μl ,每组设6个复孔。24 h后,各孔加入10 μl CCK-8,置于培养箱中培养1 h。采用酶标仪测定450 nm波长处吸光度(A)值。抑制率=(1-icotinib组A值/空白对照组A值)×100%。实验重复3次。

3.CCK-8法检测icotinib联合CIK对HCC827和A549细胞生长的抑制作用:

取对数生长期的HCC827和A549细胞,接种于96孔板中,104个/孔。用含0.1% FBS的RPMI-1640培养,贴壁后弃上清。实验分为联合组(6 μmol/L icotinib+CIK,CIK杀伤效靶比设置为10∶1、 20∶1、40∶1)、icotinib组(6 μmol/L icotinib)、CIK组(CIK杀伤效靶比设置为10∶1、 20∶1、 40∶1)、CIK对照组(CIK细胞数量同CIK组,无HCC827/A549)和空白对照组,每组设5个复孔。联合组和icotinib组每孔加入6 μmol/L icotinib 100 μl,CIK组、CIK对照组和空白对照组每孔加入RPMI-1640培养液100 μl,于37℃、5% CO2培养箱中培养24 h后,1 200 r/min离心5 min,移除上清。联合组、CIK组和CIK对照组每孔按效靶比加入CIK细胞100 μl,icotinib组和空白对照组每孔加入100 μl RPMI-1640,于37℃、5% CO2培养箱中培养4 h后,每孔加入10 μl CCK-8,继续培养1 h。采用酶标仪测定450 nm波长处的A值。联合组抑制率=[1-(联合组A值-CIK对照组A值)/空白对照组A值]×100%,icotinib组抑制率=(1-icotinib组A值/空白对照组A值)×100%,CIK组抑制率=[1-(CIK组A值-CIK对照组A值)/空白对照组A值]×100%。试验重复3次。

根据Chou-Talalay联合指数法[8]的量效公式,通过Calcusyn软件计算icotinib和CIK联用时对HCC827和A549细胞抑制作用的协同系数(combination index, CI)。当CI<1时,二者有协同效应;当CI=1时,二者有相加效应;当CI>1时,二者有拮抗效应。

4.Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡:

取处于对数生长期的A549和HCC827细胞,接种于6孔板中(106个/ml,2 ml/孔),用含0.1%FBS的RPMI-1640培养,贴壁后弃上清。实验分为联合组(6 μmol/L icotinib联合效靶比为10∶1、 20∶1的CIK)、icotinib组(6 μmol/L icotinib)和空白对照组,每组设3个复孔。联合组和icotinib组加入icotinib(6 μmol/L,10 μl/孔),空白对照组加入RPMI-1640培养基10 μl。培养24 h后,1 200 r/min离心5 min,移除上清。联合组加入CIK(效靶比为10∶1、 20∶1,2 ml/孔),icotinib组和空白对照组补充RPMI-1640培养基(2 ml/孔),培养4 h后,1 200 r/min离心5 min,移除上清。各组加入不含EDTA胰酶0.4 ml,消化后,1 200 r/min离心5 min,收集细胞。4℃预冷的磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline, PBS)洗涤2次,采用250 μl结合缓冲液重新悬浮细胞,调整细胞浓度为1×106个/ml。移取细胞悬液100 μl,置于试管中,加入10 μl Annexin V-FITC、10 μl PI染料以及CD3-PerCP-CY5.5,混匀后,室温避光孵育15 min,加入PBS 400 μl,流式细胞仪检测。实验重复3次。

5.流式细胞仪检测icotinib对CIK细胞亚群的影响:

将成熟的CIK细胞接种于6孔板中,1×106个/孔,1 ml/孔。实验分为icotinib组和对照组。icotinib组加入3和6 μmol/L icotinib各1 ml,对照组加入RPMI-1640培养基1 ml。培养24 h后,1 500 r/min离心5 min,弃上清,充分振匀剩余的细胞悬液。icotinib组和对照组细胞悬液分别标记荧光抗体PerCP-CD3mAb、FITC-CD4mAb、PE-CD8mAb、PE-CD56mAb、FITC-CD28mAb和PE-CD127mAb,同时设置阴性对照管。室温避光15 min,PBS洗涤1次。1 500 r/min离心5 min,弃上清,加入PBS 200 μl重悬细胞,上流式细胞仪检测。实验重复3次。

三、统计学方法

采用SPSS 13.0软件进行统计分析,对于正态分布且方差齐的计量资料,多个样本比较采用单因素方差分析,两个样本比较采用独立样本t检验;对于非正态分布或(和)方差不齐的计量资料,采用Kruskai-Wills H检验。检验水准α=0.05。

结 果
1.icotinib对HCC827和A549细胞的增殖抑制作用:

1.5、3、6、12 μmol/L icotinib对HCC827细胞的抑制率分别为(5.64±0.05)%、(8.62±0.45)%、(14.57±0.65)%和(18.52±0.91)%,icotinib对HCC827细胞的抑制率随药物浓度的增加而增高(P<0.001)。1.5、3、6、12 μmol/L icotinib对A549细胞的抑制率分别为(1.64±0.48)%、(2.09±0.28)%、(3.69±0.45)%和(4.41±0.58)%,icotinib对A549细胞的抑制率随药物浓度的增加而增高(P<0.001)。在相同浓度下,icotinib对HCC827细胞的抑制率明显高于A549细胞(P<0.05)。

2.icotinib联合CIK对HCC827和A549细胞的生长抑制作用:

icotinib组、CIK组和联合组对HCC827和A549细胞的抑制率见表1。同一效靶比的CIK对HCC827和A549细胞的抑制率差异均无统计学意义(P10∶1=0.299,P20∶1=0.318,P40∶1=0.366)。icotinib联合CIK后,除6 μmol/L icotinib+40∶1 CIK组与40∶1 CIK组对A549细胞的抑制率差异无统计学意义(P=0.089),其他各联合组对肿瘤细胞的抑制率明显高于icotinib组和同等效靶比下的CIK组(P<0.05)。采用Calcusyn软件计算CI值,icotinib与不同效靶比CIK联合作用HCC827和A549细胞后,其CI值均<1,差异均有统计学意义(均P<0.05,表2)。

表1

icotinib组、CIK组和联合组对HCC827和A549细胞的抑制率(%, ±s; n=5)

表1

icotinib组、CIK组和联合组对HCC827和A549细胞的抑制率(%, ±s; n=5)

组别HCC827细胞抑制率A549细胞抑制率P
icotinib组14.90±3.523.57±0.850.001
CIK组   
 10∶1 CIK15.17±2.3316.99±2.810.299
 20∶1 CIK42.59±7.1846.31±1.890.318
 40∶1 CIK62.59±8.9558.24±4.230.366
联合组   
 6 μmol/L icotinib+10∶1 CIK37.07±3.5025.72±1.41<0.001
 6 μmol/L icotinib+20∶1 CIK76.03±6.5552.76±3.82<0.001
 6 μmol/L icotinib+40∶1 CIK80.34±10.6962.26±1.940.006

注:icotinib:盐酸埃克替尼;CIK:细胞因子诱导的杀伤细胞

表2

icotinib与不同效靶比CIK联合作用HCC827和A549细胞的CI值(%, ±s; n=5)

表2

icotinib与不同效靶比CIK联合作用HCC827和A549细胞的CI值(%, ±s; n=5)

组别CI值P
HCC827细胞A549细胞
icotinib+10∶1 CIK组0.65±0.080.78±0.040.013
icotinib+20∶1 CIK组0.37±0.090.66±0.07<0.001
icotinib+40∶1 CIK组0.63±0.281.00±0.060.020
P0.049<0.001 

注:icotinib:盐酸埃克替尼;CIK:细胞因子诱导的杀伤细胞;CI:协同系数

3.icotinib和CIK对HCC827和A549细胞凋亡的影响:

Annexin V-FITC/PI双染法检测显示,联合组的细胞凋亡率明显高于icotinib组和空白对照组,各组间差异均有统计学意义(均P<0.05,表3)。icotinib作用肿瘤细胞后,可使早期凋亡细胞和晚期凋亡或坏死细胞比例增加。icotinib联合CIK作用肿瘤细胞后,晚期凋亡或坏死细胞比例显著上升,随着CIK效靶比的升高,其杀伤作用更强(图1图2)。

表3

icotinib和CIK作用HCC827和A549细胞的凋亡率(%, ±s; n=3)

表3

icotinib和CIK作用HCC827和A549细胞的凋亡率(%, ±s; n=3)

组别细胞凋亡率P
HCC827细胞A549细胞
空白对照组11.78±0.9412.45±0.890.417
icotinib组25.83±1.1416.14±1.590.001
icotinib+10∶1 CIK组52.03±1.7237.69±1.66<0.001
icotinib+20∶1 CIK组77.82±2.9262.84±2.450.003
P<0.001<0.001 

注:icotinib:盐酸埃克替尼;CIK:细胞因子诱导的杀伤细胞

图1
盐酸埃克替尼(icotinib)和细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)对HCC827细胞凋亡的影响 A:空白对照组;B: icotinib组;C: icotinib+10∶1 CIK组;D: icotinib+20∶1 CIK组
图1
盐酸埃克替尼(icotinib)和细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)对HCC827细胞凋亡的影响 A:空白对照组;B: icotinib组;C: icotinib+10∶1 CIK组;D: icotinib+20∶1 CIK组
图2
盐酸埃克替尼(icotinib)和细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)对A549细胞凋亡的影响 A:空白对照组;B: icotinib组;C: icotinib+10∶1 CIK组;D: icotinib+20∶1 CIK组
图2
盐酸埃克替尼(icotinib)和细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)对A549细胞凋亡的影响 A:空白对照组;B: icotinib组;C: icotinib+10∶1 CIK组;D: icotinib+20∶1 CIK组
4.icotinib对CIK细胞亚群的影响:

3、6 μmol/L icotinib作用于CIK细胞后,其对CIK表型无影响(均P>0.05,表4)。

表4

icotinib对CIK细胞亚群的影响(%, ±s; n=3)

表4

icotinib对CIK细胞亚群的影响(%, ±s; n=3)

组别CD3T细胞CD3CD4T细胞CD3CD8T细胞CD8CD28T细胞CD8CD28T细胞CD3CD56T细胞CD3CD56T细胞CD4CD25HiCD127LoT细胞
对照组83.33±6.7033.40±2.0057.27±3.5542.30±2.9815.13±3.851.75±0.3411.97±0.787.36±0.56
3 μmol/L icotinib组84.20±4.2634.53±1.5859.57±8.8042.97±1.7215.37±2.471.75±0.4511.70±0.467.42±0.45
6 μmol/L icotinib组88.07±6.3134.27±1.3456.93±4.2743.10±3.3015.87±2.111.52±0.1811.83±0.557.42±0.39
P0.6010.6990.8470.9310.9520.6470.8690.984

注:icotinib:盐酸埃克替尼;CIK:细胞因子诱导的杀伤细胞

讨 论

肺癌是我国最常见的恶性肿瘤之一,严重威胁着人们的身体健康。近年来,随着对肺癌分子靶向治疗的深入研究,EGFR-TKI已广泛应用于晚期非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)的治疗决策中。icotinib是我国自主研发的选择性EGFR-TKI,其对EGFR突变的晚期NSCLC患者疗效确切,安全性良好[9]。Ⅳ期临床研究显示,icotinib治疗晚期NSCLC患者的客观有效率(objective response rate, ORR)和疾病控制率(disease control rate, DCR)分别为30%和80%;对于EGFR敏感突变的NSCLC患者,在接受icotinib一线治疗后,其ORR和DCR分别为56.3%和95.2%[10]。本研究显示,icotinib对EGFR第19外显子缺失突变型细胞HCC827抑制作用较强,而对于EGFR野生型细胞A549抑制作用则较弱,证明了用药前基因检测的必要性。尽管靶向治疗的疗效显著,但仍有部分患者无法得到有效的治疗,或者在接受EGFR-TKIs治疗后发生获得性耐药,为此,我们需要探索新的治疗途径。

人们通过对肿瘤免疫的深入研究,意识到肿瘤的发生、发展不仅仅是单一组织或器官的恶变,而是与机体的免疫环境密切相关。对于肿瘤患者,免疫系统直接决定了治疗的有效性及生存质量。因此,肿瘤免疫治疗逐步成为抗肿瘤治疗的研究热点。肿瘤生物免疫治疗是基于分子生物学、免疫学和细胞生物学的多学科交叉渗透,通过激发或调动机体免疫反应,提高机体的抗肿瘤能力。其中CIK应用最为广泛,技术也较成熟,其可促进患者免疫系统的重建,消除残留病变,对多种恶性肿瘤均有一定的疗效。本研究中,我们应用的CIK细胞是通过分离人外周血淋巴细胞,经体外诱导扩增而培养出的、兼有T淋巴细胞抗肿瘤活性和NK细胞无主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex, MHC)限制性杀瘤特点的一群细胞。本实验培养的CIK细胞中,CD3T细胞比例为(83.33±6.70)%,CD8CD28T细胞比例为(42.30±2.98)%,而CD3CD56 T细胞比例为(11.97±0.78)%,培养体系稳定,与临床应用标准一致。在靶向治疗方面,Shi等[11]对晚期NSCLC患者应用树突状细胞-细胞因子诱导的杀伤细胞(dendritic cells-cytokine-induced killer cells, DC-CIK)联合厄洛替尼和厄洛替尼单药治疗的疗效和安全性进行了比较,结果显示,联合组的无进展生存时间(progress free survival, PFS)为5.02个月,优于单药组(3.98个月),毒性反应无明显差异。因此,靶向治疗与生物免疫治疗的联合应用是更加有效的治疗方法。

本研究结果显示,CIK细胞对EGFR是否突变不具有选择性,即对HCC827和A549细胞的抑制率差异无统计学意义,并且CIK对肿瘤细胞的杀伤作用随其效靶比的上升而提高。本研究中,当icotinib与CIK联合作用肿瘤细胞时,其杀伤活性明显高于icotinib组和CIK组,CI值均<1,二者具有协同作用。其机制可能为icotinib提高了CIK细胞对肿瘤细胞的识别,促进CIK细胞攻击肿瘤细胞。一方面,靶向药物能提高肿瘤细胞表面自然杀伤细胞2族成员D(natural-killer group 2,member D, NKG2D)配体的表达,从而提高CIK细胞对肿瘤细胞的杀伤活性[12]。NKG2D主要表达于人NK细胞、CD8T细胞和γδT细胞表面[13],参与适应性及固有性免疫应答,而其配体可在人类恶性肿瘤中表达[14]。肿瘤细胞NKG2D配体的表达水平与免疫活性细胞的抗肿瘤活性密切相关。icotinib对肿瘤细胞NKG2D表达的影响值得进一步深入研究。另一方面,肿瘤微环境有利于肿瘤细胞逃避和抑制抗肿瘤免疫,而通过输注具有免疫效应的CIK细胞,可显著改善肿瘤微环境,促进靶向药物发挥作用,有可能在一定程度上减轻靶向药物的毒副反应,延缓耐药性和转移的发生。本研究中,icotinib与效靶比20∶1的CIK联用时,其协同效应最强;icotinib与效靶比40∶1的CIK联用时,未能进一步提高协同效应,提示在临床使用时无需追求最高效靶比,只要合理搭配联合用药比例,在有效性、毒副反应及费用方面达到最佳组合。对于A549细胞,在高效靶比(40∶1)CIK时,是否联用icotinib对细胞的抑制率无影响,可见icotinib对A549细胞的作用有限,在高效靶比CIK情况下,以CIK细胞的杀伤作用为主,icotinib联合40∶1 CIK的CI值接近1也验证了此时两药联合的协同效应很小,趋向于相加效应。从细胞凋亡实验结果来看,icotinib作用于肿瘤细胞后,可使早期凋亡细胞和晚期凋亡或坏死细胞比例增加;icotinib联合CIK作用肿瘤细胞后,晚期凋亡或坏死细胞比例显著上升,说明联合用药的杀伤力更强。为排除icotinib对CIK的影响,我们对icotinib作用后CIK的表型进行了检测,结果显示,icotinib对CIK表型基本无影响,有效验证了icotinib的靶向性。

综上所述,icotinib与CIK联合应用能显著增加对肺腺癌细胞的杀伤作用,为靶向药物与生物治疗联合应用于临床提供了一定的基础理论依据,但还需进一步临床验证及深入研究。

利益冲突

利益冲突 无

参考文献
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关键词
主题词
肺肿瘤
盐酸埃克替尼
细胞因子诱导的杀伤细胞
细胞凋亡