54
阅读
0
评论
分享
临床研究
与细胞形态相结合的荧光原位杂交技术在纤维支气管镜刷检细胞学诊断肺癌中的价值
中华肿瘤杂志, 2017,39(08): 595-599. DOI: 10.3760/cma.j.issn.0253-3766.2017.08.007
摘要
目的

探讨与细胞形态相结合的荧光原位杂交(FISH)技术在纤维支气管镜刷检细胞学诊断肺癌中的价值。

方法

选取7、8及17号染色体着丝粒探针(CEPs),对69例纤维支气管镜细胞学标本进行与细胞学形态学相结合的FISH检测。

结果

FISH检测显示,在细胞学诊断为癌细胞中,CEP7、CEP8和CEP17的阳性率分别为50.0%、80.8.%和65.4%,CEP8与CEP7的阳性率差异有统计学意义(P=0.015)。在细胞学诊断为可疑癌细胞中,CEP7、CEP8和CEP17的阳性率分别为46.6%、66.7%和58.8%。在细胞学诊断为非典型细胞中,CEP7、CEP8和CEP17的阳性率分别为20.0%、33.3%和25.0%。CEP7、CEP8、CEP17在可疑癌和非典型细胞间的差异均无统计学意义(均P>0.05),在癌与可疑癌细胞间的差异均无统计学意义(均P>0.05)。所有良性细胞均未见染色体异常改变。肺腺癌中CEP7、CEP8和CEP17的阳性率均高于肺鳞状细胞癌和小细胞肺癌,但仅肺腺癌与小细胞肺癌的CEP8阳性率差异有统计学意义(P=0.044)。以CEP7、CEP8、CEP17任一阳性为标准,其与细胞形态相结合的FISH诊断肺癌的敏感度为80.3%,特异度为100.0%。细胞学诊断肺癌的敏感度为54.1%,特异度为100.0%。

结论

与细胞形态相结合的FISH技术可以辅助诊断纤维支气管镜刷检细胞学中不能确诊的患者(可疑癌及非典型细胞),从而提高纤维支气管镜刷检细胞学诊断肺癌的敏感度,且不降低其诊断的特异度。

引用本文: 卢珊珊, 潘秦镜, 曹箭, 等.  与细胞形态相结合的荧光原位杂交技术在纤维支气管镜刷检细胞学诊断肺癌中的价值 [J]. 中华肿瘤杂志,2017,39( 8 ): 595-599. DOI: 10.3760/cma.j.issn.0253-3766.2017.08.007
正文
作者信息
基金  关键词  主题词
English Abstract
评论
阅读 54 引用 0
相关资源
视频 0 论文 0 大综述 0
以下内容和版式版权归属中华医学会,未经授权不得转载 ×

目前,肺癌是威胁人类生命和健康的最主要恶性肿瘤之一。根据美国癌症协会数据,2015年美国肺癌死亡人数位列所有癌症之首[1]。在我国,肺癌的发病率在过去30年增加了465%,而死亡率已跃居各类恶性肿瘤之首[2]。肺癌的发病率和死亡率十分接近,究其原因,绝大部分患者在明确诊断时已为中晚期,而晚期肺癌患者生存率仅有4%[3]。因此,寻找一种有效的早期诊断方法是提高肺癌生存率的关键之一。纤维支气管镜刷片细胞学检查简便、微创,准确率较高,是肺癌诊断和病情监测的主要手段[4]。但肺癌细胞的形态多种多样,分化好的恶性肿瘤常与良性反应性增生难以鉴别,以中国医学科学院肿瘤医院为例,2015年诊断为可疑癌和非典型细胞的患者占所有患者的16.2%[5],这些单凭细胞形态学不能明确诊断的病例给细胞病理医师、临床医师及患者都带来困扰。

肺癌的发生、发展经历了复杂的染色体和遗传学改变。荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization,FISH)是一种采用荧光标记的DNA探针在显微镜下评估细胞染色体异常的技术。有研究表明,FISH可以提高支气管镜刷检细胞学诊断肺癌的敏感性,但无法解释对细胞形态学不能确诊的病例能否结合其染色体水平的改变来进一步明确诊断[6,7,8,9,10]。本研究中,我们通过与细胞形态相结合的FISH技术,分析纤维支气管镜刷片细胞学诊断为癌细胞、可疑癌细胞、非典型细胞和良性细胞中7、8和17染色体的异常变化,以确定该检测技术在纤维支气管镜刷片细胞学,特别是在不能明确诊断的患者中应用的可行性及临床价值。

资料与方法
1.病例选择:

选取2010年6月至2011年3月间中国医学科学院肿瘤医院细胞室纤维支气管镜刷检细胞学临床诊断剩余标本69例,其中男性49例,女性20例。年龄27~80岁,平均年龄57.4岁。所有患者在细胞学诊断后均进行随访,随访12~22个月,平均随访时间为16.8个月。选出细胞学诊断为癌细胞、可疑癌细胞、非典型细胞和良性反应性细胞,用钻石笔将需要观察的细胞做标记,并将标记的细胞全部拍照留档,荧光显微镜下定位,记录坐标。

2.FISH检测前细胞学薄片预处理:

将标记后的薄片依次置入二甲苯溶液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ进行脱胶,100%乙醇洗去二甲苯,依次浸入85%、70%乙醇后,蒸馏水漂洗。另取0.1 μl正常人外周血淋巴细胞中期染色体标本,作为正常细胞对照。

3.FISH检测:

(1)将着丝粒计数探针(centromeric enumeration probe, CEP)7、CEP8和CEP17(中国医学科学院肿瘤医院分子肿瘤学国家重点实验室提供)、ssDNA (美国Sigma公司)、Cot-1DNA (美国Invitrogen公司)混合后摇匀,放入预先配好的杂交液(7% Tween水1.5 μl、FA 6 μl、硫酸葡聚糖2.5 μl)中,73℃水浴中变性8 min。(2)每张玻片加入RNaseA 60 μl,37℃湿盒孵育40 min;然后加入稀释的2.5×胃蛋白酶(pepsin)60 μl,37℃湿盒孵育15 min;再将玻片置于1%多聚甲醛溶液中固定10 min;70%去离子甲酰胺中,73℃变性3 min;最后,在预先冷却的2×SSC中洗涤,梯度乙醇脱水。(3)取出变性后备用的探针混合液,滴加在玻片上所要观察的目标细胞位置,置于湿盒内37℃过夜。(4)将玻片浸入43℃预热的50%去离子甲酰胺中15 min,2×SSC中洗涤。(5)4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(4′,6-diamidino-2- phenylindole,DAPI)复染。

4.FISH图像的获取:

按照预先记录的坐标找到血点和标记细胞区域,使用63倍物镜(油镜)观察杂交后涂片的信号。将4次拍摄的DAPI、光谱绿、CY3和CY5图像分别赋予蓝、绿、红和黄4种颜色,随后将其合成为彩图。

5.FISH判读标准:

根据Savic等[11]和本研究与细胞形态相结合FISH的特点,我们采取以下标准:任何一个探针至少在3个同一类细胞中出现多体(≥3体)就认为这个染色体发生了畸变,即这个探针FISH结果阳性。

6.统计学方法:

采用SPSS 16.0软件进行统计分析,计数资料的比较采用χ2检验和Fisher精确概率法,检验水准α=0.05。

结 果
1.临床诊断结果:

69例患者中,有60例经组织病理诊断为肺癌,其中鳞状细胞癌29例,浸润性腺癌24例,小细胞癌6例,多形性癌1例;有1例影像学诊断为右肺癌,胸腔积液伴全身多发转移,胸水细胞学可见癌细胞;有8例经组织病理诊断为正常或良性病变。61例肺癌患者中,细胞学诊断为癌细胞33例,可疑癌细胞17例,非典型细胞6例,阴性5例(表1)。8例正常或良性病变中,细胞学诊断均为阴性。细胞学诊断肺癌的敏感度为54.1%(33/61),特异度为100.0%。

表1

61例肺癌患者的细胞学诊断结果

表1

61例肺癌患者的细胞学诊断结果

细胞学诊断例数
癌细胞 
 鳞状细胞癌11
 腺癌7
 小细胞癌5
 癌细胞(非小细胞型)10
可疑癌细胞 
 可疑鳞癌细胞7
 可疑腺癌细胞5
 可疑癌细胞(非小细胞型)5
非典型细胞6
阴性5
2.不同细胞学诊断结果中FISH检测的成功率和阳性率:

在细胞学诊断为癌、可疑癌、非典型细胞中,CEP7、CEP8和CEP17的FISH检测成功率和阳性率见表2。在细胞学诊断为癌细胞中,CEP8的阳性率高于CEP7 (P=0.015),而CEP8与CEP17、CEP7与CEP17的阳性率差异均无统计学意义(均P>0.05)。在细胞学诊断为癌和可疑癌细胞中,CEP7、CEP8和CEP17的阳性率差异均无统计学意义(均P>0.05)。在细胞学诊断为可疑癌和非典型细胞中,CEP7、CEP8和CEP17的阳性率差异均无统计学意义(均P>0.05)。在细胞学诊断为阴性者中,CEP7、CEP8和CEP17均为阴性。

表2

61例肺癌患者的细胞学诊断结果与CEP7、CEP8和CEP17检测结果的关系(例)

表2

61例肺癌患者的细胞学诊断结果与CEP7、CEP8和CEP17检测结果的关系(例)

细胞学诊断例数CEP7检测CEP8检测CEP17检测
成功阳性成功阳性成功阳性
癌细胞3332(97.0)16(50.0)26(78.8)21(80.8)26(78.8)17(65.4)
可疑癌细胞1715(88.2)7(46.7)15(88.2)10(66.7)12(70.6)7(58.3)
非典型细胞65(83.3)1(20.0)6(100.0)2(33.3)4(66.7)1(25.0)
阴性54(80.0)0(0.0)4(80.0)0(0.0)3(60.0)0(0.0)

注:CEP:着丝粒计数探针;( )内为%

3.肺癌组织病理类型与FISH检测结果的关系:

CEP7、CEP8和CEP17的FISH检测结果与肺癌组织病理类型的关系见表3。CEP7、CEP8和CEP17在腺癌中的阳性率稍高于鳞状细胞癌和小细胞癌,但仅CEP8在腺癌中的阳性率与小细胞癌的阳性率差异有统计学意义(P=0.044),而CEP7和CEP17在鳞癌、腺癌和小细胞癌中的阳性率差异均无统计学意义(均P>0.05)。

表3

肺癌组织病理类型与FISH检测结果的关系(例)

表3

肺癌组织病理类型与FISH检测结果的关系(例)

组织病理类型例数CEP7检测CEP8检测CEP17检测
成功阳性成功阳性成功阳性
鳞状细胞癌292612(46.2)2216(72.7)2011(55.0)
腺癌242412(50.0)2420(83.3)2415(62.5)
小细胞癌662(33.3)41(25.0)64(66.7)
正常或良性病变880(0.0)70(0.0)80(0.0)

注:FISH:荧光原位杂交;CEP:着丝粒计数探针;( )内为%

4.与细胞形态相结合的FISH在辅助纤维支气管镜诊断肺癌中的作用:

在细胞学诊断为可疑癌和非典型细胞患者中,以CEP7、CEP8、CEP17任意3、2和1个阳性为标准,其与细胞形态相结合的FISH诊断敏感度分别为59.0%、67.2%和80.3%,特异度均为100.0%。细胞学诊断肺癌的敏感度和特异度分别为54.1%和100.0%。其中以CEP7、CEP8、CEP17任一阳性为标准,其与细胞形态相结合的FISH可明显提高细胞学诊断的敏感度(P=0.002),且不降低细胞学诊断的特异度(表4图1图2图3)。

表4

61例肺癌患者的细胞学诊断结果与CEP7、CEP8和CEP17联合检测结果的关系(例)

表4

61例肺癌患者的细胞学诊断结果与CEP7、CEP8和CEP17联合检测结果的关系(例)

细胞学诊断例数3个CEP检测≥2个CEP检测≥1个CEP检测
成功阳性成功阳性成功阳性
癌细胞33185(27.8)3319(57.6)3330(90.9)
可疑癌细胞17103(30.0)177(41.2)1713(76.5)
非典型细胞630(0.0)61(16.7)63(50.0)
阴性540(0.0)40(0.0)50(0.0)

注:CEP:着丝粒计数探针;( )内为%

图1
细胞学诊断为癌细胞的荧光原位杂交(FISH)检测

A:细胞学诊断为鳞状细胞癌 巴氏染色 ×400; B: FISH检测显示,CEP7(绿)、CEP8(红)和CEP17(黄)多倍体 ×630

图1
细胞学诊断为癌细胞的荧光原位杂交(FISH)检测
图2
细胞学诊断为可疑癌细胞的荧光原位杂交(FISH)检测

A:细胞学诊断为可疑腺癌 巴氏染色 ×400; B: FISH检测显示,CEP7(绿)和CEP17(黄)多倍体,CEP8(红)二倍体 ×630

图2
细胞学诊断为可疑癌细胞的荧光原位杂交(FISH)检测
图3
细胞学诊断为非典型细胞的荧光原位杂交(FISH)检测

A:细胞学诊断为非典型细胞 巴氏染色 ×400; B: FISH检测显示,CEP7(绿)和CEP8(红)多倍体 ×630

图3
细胞学诊断为非典型细胞的荧光原位杂交(FISH)检测
讨 论

纤维支气管镜刷检细胞学标本由于混有较多的呼吸道分泌物和黏液,细胞类型复杂且病变细胞数量少,使得传统的FISH在细胞学标本中的应用受到限制。本研究中,我们采用细胞学诊断后剩余标本,重新制片染色,在显微镜下观察、标记出需要FISH研究的目标细胞,荧光显微镜下定位,然后进行目标细胞的FISH检测。我们把这种锁定目标细胞进行FISH检测的方法称为与细胞形态结合的FISH检测,其优点是:(1)细胞形态与染色体相结合,进一步加深了我们对肺癌细胞形态及分子水平的认识;(2)针对特定的异常细胞进行FISH标记,既减少了计数所需的细胞量,又增加了判读的准确性。

与细胞形态结合的FISH检测在技术操作上存在一定难度。我们有以下体会:(1)涂片必须彻底脱胶,以减少非特异性背景着色。(2)以往研究通常采用间期核片标本[10],即细胞经低渗处理,细胞核外细胞质破碎缺失;而本研究的细胞涂片未经过低渗处理,细胞核外仍有细胞质包裹,细胞质会引起背景非特异荧光着色干扰对信号的判读。为减少细胞质引起的背景干扰,我们经蛋白酶消化强度梯度实验,选定2.5×pepsin、37℃湿盒内孵育15 min为本研究消化条件,采用此消化条件处理涂片后,镜下细胞核清晰,背景干净,能够较好的辨别信号进行计数。

肺癌的发生、发展伴随着许多分子细胞遗传学的改变,特定染色体畸变可能导致一些细胞的恶性转化。以往的研究显示,肺癌的发生常常伴有7号染色体数目异常[12]。Bozzetti等[13]研究了33例肺癌患者细胞学标本中表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor, EGFR)基因扩增情况,其中7号染色体多体17例(51.5%),多于EGFR基因扩增(6.1%)。本研究中,CEP7的阳性率为50.0%。而8号染色体数目异常可见于肺癌、结肠癌和膀胱癌等多种实体肿瘤中,与细胞恶性转变相关的重要癌基因c-myc就位于8q22-24,c-myc可以通过基因扩增、转录后调控异常等方式激活,从而促进细胞增殖[14]。本研究显示,癌细胞中CEP8阳性率为80.8%,高于Liu等[10]报道的67.0%,这可能与我们采用与细胞形态相结合的FISH检测有关。此外,本研究还显示,腺癌中CEP8的阳性率明显高于小细胞癌(P<0.05)。由于17号染色体上有多个与肿瘤发生、发展相关的重要基因,如p53、表皮生长因子受体2(human epidermal growth factor receptor 2,HER-2)、DNA拓扑异构酶Ⅱα(DNA topoisomerase Ⅱ alpha,Topo Ⅱα)等,所以17号染色体异常有很重要的研究价值[15]。Nakamura等[16]对40例细胞学标本进行FISH检测,以CEP3或CEP17任一阳性为FISH结果阳性,其敏感度和特异度分别为87.1%和100%。而本研究中,CEP17在癌细胞中的阳性率为65.4%。

此外,我们还发现,在癌、可疑癌和非典型细胞中均可检测出不同比例的7、8和17号染色体多体,虽然随着细胞形态学异常改变加重,CEP7、CEP8和CEP17的阳性率也上升,但其在癌细胞与可疑癌细胞中的阳性率差异无统计学意义,尤其是CEP7在癌、可疑癌和非典型细胞中的阳性率差异均无统计学意义。由此说明,尽管肿瘤表面脱落的细胞会有不同程度的形态学改变,但这些形态学表现不同的细胞在染色体水平上的改变却趋于一致,而这种改变未见于良性细胞。

在细胞学诊断为可疑癌和非典型细胞中结合应用与细胞形态学相结合的FISH检测,以任一CEP阳性为标准,则诊断敏感度可以提高至80.3%,明显高于细胞学诊断的敏感度(54.1%,P=0.002);以任意2个CEP同时阳性为标准,则诊断敏感度可以提高至67.2%;且两者均不降低细胞学诊断的特异性(100.0%)。我们的研究与Savic等[11]的研究结果相符合,也表明与细胞形态学相结合的FISH检测技术在临床细胞学诊断中具有较好的应用价值。

综上所述,肺癌患者中7、8、17号染色体呈多体表现,而良性病变患者未见此改变。因此,采用与细胞形态相结合的FISH技术检测7、8和17号染色体多体,可以辅助诊断纤维支气管镜刷检细胞学中不能确诊的患者(可疑癌及非典型细胞),提高纤维支气管镜刷检细胞学诊断肺癌的敏感度。

利益冲突

利益冲突 无

参考文献
[1]
SiegelRL, MillerKD, JemalA, et al. Cancer statistics,2015[J]. CA Cancer J Clin,2015, 65(1):5-29. DOI: 10.3322/caac.21254.
[2]
WenC, DehnelT. China wrestles with lung cancer[J]. Lancet Oncol,2011, 12(1):15. DOI: http://dx.doi.org/10.1016/S1470-2045(10)70303-X.
[3]
SiegelR, WardE, BrawleyO, et al. Cancer statistics, 2011:the impact of eliminating socioeconomic and racial disparities onpremature cancer deaths[J]. CA Cancer J Clin,2011, 61(4):212-236. DOI: 10.3322/caac.20121.
[4]
曹箭潘秦镜李中林. 纤支镜ThinPrep技术刷片细胞病理检查的诊断价值[J].中华肿瘤杂志2006, 28(7):536-538.
CaoJ, PanQJ, LinZL, et al. Value of ThinPrep bronchial brushing cytology in the diagnosis of lung cancers[J]. Chin J Oncol,2006, 28(7):536-538.
[5]
赵焕郭会芹张传欣. 纤维支气管镜下刷取标本液基细胞学检查在肺癌临床诊断中的价值[J]. 中华肿瘤杂志2015, 37(6):434-434. DOI: 10.3760/cma.j.issn.0253-3766.2015.06.007.
ZhaoH, GuoHQ, ZhangCX, et al. Value of liquid-based cytology of brushing specimens obtained via fiberoptic bronchoscopy for the diagnosis of lung cancer[J]. Chin J Oncol,2015, 37(6):431- 435. DOI: 10.3760/cma.j.issn.0253-3766.2015.06.007.
[6]
BalsaraBR, TestaJR. Chromosomal imbalances in human lung cancer [J]. Oncogene,2002, 21(45):6877-6883. DOI: 10.1038/sj.onc.1205836.
[7]
HallingKC, KippBR. Fluorescence in situ hybridization in diagnostic cytology[J]. Hum Pathol,2007, 38(8):1137-1144. DOI: 10.1016/j.humpath.2007.04.015.
[8]
HallingKC, RickmanOB, KippBR, et al. A comparison of cytology and fluorescence in situ hybridization for the detection of lung cancer in bronchoscopic specimens[J]. Chest,2006, 130(3):694-701. DOI: 10.1378/chest.130.3.694.
[9]
ZhaiJ. Multitarget fluorescence in situ hybridization assay for the detection of lung cancer in bronchial cytology specimens: a comparison with routine cytology[J]. Diagn Cytopathol,2015, 43(10):819-824. DOI: 10.1002/dc.23310.
[10]
LiuYZ, WangZ, FangLL, et al. A potential probe set of fluorescence in situ hybridization for detection of lung cancer in bronchial brushing specimens[J]. J Cancer Res Clin Oncol,2012, 138(9):1541-1549. DOI: 10.1007/s00432-012-1232-0.
[11]
SavicS, GlatzK, SchoeneggR, et al. Multitarget fluorescence in situ hybridization elucidates equivocal lung cytology[J]. Chest,2006, 129(6):1629-1635. DOI: 10.1378/chest.129.6.1629.
[12]
SimoneG, MangiaA, MalfettoneA, et al. Chromogenic in situ hybridization to detect EGFR gene copy number in cell blocks from fine-needle aspirates of non small cell lung carcinomas and lung metastases from colo-rectal cancer[J]. J Exp Clin Cancer Res,2010, 29125-131. DOI: 10.1186/1756-9966-29-125.
[13]
BozzettiC, TiseoM, LagrastaC, et al. Is cytology reliable for epidermal growth factor receptor gene evaluation in non-small cell lung cancer? [J]. J Thorac Oncol,2010, 5(4):551-553. DOI: 10.1097/JTO.0b013e3181ce3b28.
[14]
SeoAN, YangJM, KimH, et al. Clinicopathologic and prognostic significance of c-MYC copy number gain inlungadenocarcinomas[J]. Br JCancer,2014, 110(11):2688-2699. DOI: 10.1038/bjc.2014.218.
[15]
PananiAD, RoussosC. Cytogenetic and molecular aspects of lung cancer[J]. Cancer Lett,2006, 239(1):1-9. DOI: 10.1016/j.canlet.2005.06.030.
[16]
NakamuraH, AuteI, KawasakiN, et al. Quantitative detection of lung cancer cells by fluorescence in situ hybridization: comparison with conventional cytology[J]. Chest,2005, 128(2):906-911. DOI: 10.1378/chest.128.2.906.
 
 
关键词
主题词
肺肿瘤
诊断
荧光原位杂交
纤维支气管镜刷检细胞学